信帆生物：測序方法大比拼
更新時間：2016-05-18 點擊次數(shù)：1016次生物通報道：多細胞生物的每個細胞都攜帶著相同的遺傳學(xué)信息。不過，近年來蓬勃發(fā)展的單細胞研究告訴我們，每一個細胞都是*的。不同類型的細胞激活特定組合的機制，即使是同類型細胞，基因表達也會出現(xiàn)差異。
那么，細胞之間的哪些差異有生物學(xué)意義，哪些差異來自于技術(shù)偏好呢？要獲得可靠的結(jié)果又需要研究多少細胞呢？這些問題曾經(jīng)是單細胞研究（尤其是單細胞轉(zhuǎn)錄組研究）的攔路虎，令人望而卻步。單細胞RNA測序（scRNA-seq）和單細胞數(shù)據(jù)分析工具在這方面為人們提供了很大的幫助。
The Scientist雜志zui近了單細胞研究領(lǐng)域的一些專家，請他們分享了在單細胞中進行轉(zhuǎn)錄研究的秘訣。希望幫助研究者們更好地構(gòu)建文庫，處理和分析結(jié)果數(shù)據(jù)。
上接：單細胞研究指南：細胞分離
測序方法大比拼
在單細胞研究的大潮中，新的測序方法層出不窮。不過，很少有人對這些方法進行系統(tǒng)的比對。慕尼黑大學(xué)生物學(xué)家Wolfgang Enardzui近領(lǐng)導(dǎo)團隊，在小鼠胚胎干細胞的基因表達研究中比較了一些常用的單細胞測序方法，包括Smart-seq、CEL-seq、SCRB-seq和Drop-seq。
Smart-seq
SMART（Switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript）是一個具有里程碑意義的重要技術(shù)。實際上，能夠從單細胞生成全長cDNA的測序方案并不多，Smart-seq就是其中之一。對于等位基因特異性表達或者剪接變體研究來說，覆蓋整個轉(zhuǎn)錄組是一件非常重要的事情。
Fluidigm C1單細胞制備系統(tǒng)能夠自動完成Smart-seq步驟。你只需要將制備好的細胞懸液加進去，儀器就會分離并裂解細胞，把mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再對cDNA進行擴增。擴增后的cDNA可以拿來測序，也可以進行qPCR檢測。
了解Fluidigm的C1單細胞自動制備系統(tǒng)的更多信息
在Enard的比較研究中，F(xiàn)luidigm C1系統(tǒng)的Smart-seqzui為靈敏，成本也zui高。這一系統(tǒng)使用的微流體芯片不能重復(fù)使用，不過這種芯片可以放到顯微鏡下觀察，證實健康單細胞的存在。
斯坦福大學(xué)的學(xué)者Stephen Quake及其團隊利用Fluidigm C1單細胞制備系統(tǒng)，對人類大腦皮層的482個單細胞進行了高通量轉(zhuǎn)錄組測序，zui終得到了466個單細胞的RNA測序數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)分析表明，單細胞測序結(jié)果不但能用于區(qū)分神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞以及血管細胞，還能將神經(jīng)元分為五類興奮性細胞和兩類抑制性細胞。（更多信息請參見：單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，繪制人腦細胞圖譜）
CEL-seq
CEL-seq（Cell expression by linear amplification and sequencing）是一種采用線性擴增的常用測序方法。線性擴增的主要優(yōu)勢是錯誤率比較低，不過線性擴增和PCR都存在序列依賴性偏好。
CEL-seq技術(shù)發(fā)表于2012年，主要是分離單細胞，逆轉(zhuǎn)錄帶有poly-A 尾巴的mRNA片段，給它們貼上代表其細胞來源的條碼。2014年Science雜志發(fā)布的MARS-seq與CEL-seq很類似。
CEL-seq和其他線性擴增方法生成文庫花費的時間要稍微長一點。不過，CEL-seq在早期階段就給樣本貼上條碼并進行混合，大大減少了手動操作的時間。PCR是在zui后階段使用的，主要是為了連接正確的測序接頭，CEL-seq紐約大學(xué)的Itai Yanai介紹到。
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