基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2/9明膠電泳試劑盒操作步驟
更新時間：2016-07-13 點擊次數(shù)：1185次檢測步驟：
1. 制備含 MMP 底物蛋白的 SDS-PAGE 凝膠：分離膠濃度為 8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備 SDS- PAGE 凝膠。將 10 × substrate G 融化，并 90 ºC 加熱 5 分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加 入 10 × substrate G 并使之稀釋 10 倍，混勻后加入過硫酸銨和 TEMED，等待凝膠聚合。
2. 待測樣品 1:1 稀釋于 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer （用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue），混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅 使用不加還原劑的上樣緩沖液?？赏ㄟ^預(yù)試驗確定加樣量，使用普通蛋白預(yù)染 Marker 即可。陽 性對照（可選步驟）：可取人、小鼠、大鼠或兔 100µl 全血與 100µl 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 等體積混合，取 5-15µl 上樣。
3. 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為 20 mA/gel。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時結(jié)束電泳。
4. 洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內(nèi)。可先用適量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10 ml1× Buffer A（用蒸餾水稀釋），室溫漂洗凝膠 2 × 30 分鐘。中間換液。
5. 孵育：倒掉 Buffer A。加入 10 ml 1× Buffer B（蒸餾水稀釋），室溫或 37ºC 孵育 1~5 小時。陽性 對 照或者血中的 MMP 通常 37ºC 孵育 1 小時即可顯示。如 MMP 活性低，應(yīng)延長孵育時間為 10 小時或 過一夜。
6. 顯色：倒掉 Buffer B，加入 SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液（操作步驟見 SDS-PAGE 凝 膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說明書）。凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有 MMP 條帶的位置 不被染 色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置（酶譜）及 活性。陽 性對照將在 66~72 （MMP-2）、92 （MMP-9）、130 （proMMP-9）、225 （proMMP-9） kDa 位置出現(xiàn)透 明條帶。
7. 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然 MMP 條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決 辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示，并盡量設(shè)置為黑 色。MMP 條帶則為白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。
基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2/9明膠電泳試劑盒操作步驟
