信帆生物對(duì)于免疫組化與抗原修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用
更新時(shí)間:2016-11-30 點(diǎn)擊次數(shù):1415次現(xiàn)AR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于免疫組化(IHC)各領(lǐng)域的研究,例如在診斷病理學(xué)和IHC的標(biāo)準(zhǔn)化方面。對(duì)原來(lái)僅表達(dá)在冰凍切片上的抗原,利用AR后絕大部分抗體能用于常規(guī)甲醛固定的石蠟切片上,對(duì)IHC回顧性研究和病理IHC鑒別診斷,腫瘤患者術(shù)后的預(yù)后檢測(cè)及療效評(píng)估具有積極的意義。
一、 AR技術(shù)
加熱AR技術(shù)
微波加熱方法. 在傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法,經(jīng)脫蠟、脫水和用3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧(化)物酶,石蠟切片經(jīng)蒸餾水沖洗,放置在塑料Coplin缸中。加入AR液,如蒸餾水、緩沖液、金屬鹽液、尿素等,蓋上并置家用微波爐加熱5或10分鐘(注意防止切片干躁)。有時(shí)在加熱5分鐘后,間隔1分鐘,再加熱5分鐘(在*個(gè)5分鐘后檢測(cè)液體高度)。加熱后,從微波爐取出塑料Coplin缸,冷卻15分鐘。片子經(jīng)蒸餾水沖洗二次后在PBS液中浸5分鐘,才進(jìn)行IHC染色。為了保持一致的加熱條件,必須設(shè)定靠近微波爐中心相同的位置及同一編號(hào)的Coplin缸 ,按照不同的抗體設(shè)定不同的加熱時(shí)間,盡可能的建立標(biāo)準(zhǔn)的加熱條件。
微波(MW)加熱過(guò)程如下:在盒內(nèi)放入200ml檸檬酸緩沖液(PH6.0±0.1),并蓋上帶有小孔的蓋子,微波加熱至沸騰;將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架中,放入已沸騰緩沖液中,有作者提供做免疫組化時(shí)采用微波爐中等功率800W[3],微波爐選用解凍檔的國(guó)產(chǎn)家用微波爐(根據(jù)目前的研究,建議用醫(yī)用微波爐),中檔繼續(xù)處理10-20分鐘;取出微波塑料缸冷卻至室溫,從緩沖液中取出玻片,片子經(jīng)蒸餾水沖洗二次,之后用PBS(PH7.2-7.4)沖洗兩次,每次3分鐘。
盡管有少數(shù)作者[4]認(rèn)為經(jīng)高溫后冷卻這一步省略。在我們觀點(diǎn),15分鐘的冷卻必須的幾點(diǎn)理由:1、如這一步省略,對(duì)于有些抗體而言,會(huì)降低AR-IHC染色強(qiáng)度。2、突然從高溫到低溫可導(dǎo)致組織片掉片。3、可能引起形態(tài)學(xué)的變化。
單純加熱方法. 將切片放入盛有檸檬酸緩沖液的容器中,置電爐(600W)上加熱至沸騰,并持續(xù)10min 。Shi等人[2]用單純加熱方法與微波加熱方法比較IHC染色強(qiáng)度,顯示兩種方法導(dǎo)致相同的染色強(qiáng)度。
非加熱AR技術(shù)
非加熱AR技術(shù)包括酶消化、酸水解等方法。目前,主要是酶消化,酶消化是以化學(xué)的方法來(lái)打斷醛鍵,修復(fù)抗原。
胰蛋白酶消化法.取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入100ml0.05%或0.1%PH7.8的無(wú)水氯化鈣水溶液中,溶解即可;或由邁新提供的0.125%的液體胰酶。將切片放入濕盒內(nèi)37oC溫箱中消化18-20分鐘。
胃蛋白酶消化法 . 用0.1mol/L HCL配制成0.4%的胃蛋白酶;
鏈霉蛋白酶消化法 . 將鏈霉蛋白酶溶于0.5mol/LpH7.4的Tris-HCL中,濃度為o.1%,消化時(shí)間20min。
抗原修復(fù)的方法選擇,關(guān)系到組織抗原能否暴露充分,這對(duì)免疫組化染色效果有很大影響。因此應(yīng)當(dāng)根據(jù)不同的抗原特點(diǎn),采用不同的修復(fù)方法。對(duì)某些細(xì)胞內(nèi)抗原(如Fas、Bax、FⅧ等)和細(xì)胞間質(zhì)抗原(如Laminin、CoIV等)則需要用酶消化法處理切片。常用的消化酶為胰蛋白酶和胃蛋白酶。一般說(shuō)來(lái),胰蛋白酶消化能力較胃蛋白酶弱,主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的消化,胃蛋白酶主要用于細(xì)胞間抗原的消化。工作中要認(rèn)真參照抗體說(shuō)明書指示進(jìn)行消化酶的選擇,這樣針對(duì)性更強(qiáng),標(biāo)記效果更理想。
二、AR應(yīng)注意的問(wèn)題
加熱持續(xù)時(shí)間和強(qiáng)度是重要的影響因素之一,AR液的PH值、濃度、化學(xué)成分也是重要的影響因素之一。使用低PH值A(chǔ)R液必須使用陰性對(duì)照片,以防止定位不準(zhǔn)[9]。Shi等人[10]強(qiáng)調(diào)修復(fù)緩沖液的PH值對(duì)某些抗原的修復(fù)十分重要,實(shí)驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn)要獲得滿意結(jié)果必須選擇抗原修復(fù)液的zui適PH值。在常規(guī)石蠟切片做AR-IHC,采用不同濃度的Alcl3液做AR液,發(fā)現(xiàn)4%的Alcl3取得的染色[11]。在修復(fù)的抗原中,金屬鹽可影響蛋白的結(jié)構(gòu)。鄭輝等人[12]使用0.01mmol/LPBS、0.01mol/L檸檬酸緩沖液、0.1mol/L Tris-HCL緩沖液及1mmol/L EDTA-Na2,于微波修復(fù)抗原,發(fā)現(xiàn)其陽(yáng)性強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。
高溫抗原修復(fù)因其機(jī)理相當(dāng)復(fù)雜,對(duì)某些存在的問(wèn)題很難用設(shè)計(jì)對(duì)照的方法加以解決,有些抗體在冰凍切片上呈陰性反應(yīng),但在石蠟切片用抗原修復(fù)后卻能很好的顯示。對(duì)某些應(yīng)表達(dá)在胞漿或表達(dá)在核內(nèi)的抗原,經(jīng)過(guò)量修復(fù)后,絕大部分表達(dá)在核內(nèi),例如,P185、Bcl-2、P-gp、Nm23,而有些表達(dá)在核內(nèi)的抗原經(jīng)過(guò)量修復(fù)會(huì)出現(xiàn)在胞漿內(nèi),例如P53、PcNA、Ki-67等[6]。在使用該方法時(shí)一定小心,對(duì)結(jié)果的判斷也要客觀地作出分析,侯寧等人發(fā)現(xiàn)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TRT)經(jīng)過(guò)抗原修復(fù)與不經(jīng)過(guò)抗原修復(fù),其染色效果明顯不同,后者的陽(yáng)性率明顯高于前者[8]。操作中還應(yīng)注意如下問(wèn)題:
1、熱處理后應(yīng)注意自然冷卻。
2、熱處理時(shí)要防止切片干燥。
3、應(yīng)根據(jù)不同的抗體選擇合適的抗原修復(fù)方法。
4、一批抗原的檢測(cè)其溫度和時(shí)間一定保持一致。
5、注意形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的改變(一般經(jīng)高溫修復(fù)后胞漿會(huì)明顯的破壞,而對(duì)細(xì)胞核的影響,會(huì)出現(xiàn)核破裂,蘇木素淡染等現(xiàn)象,而經(jīng)酶水解的切片,其細(xì)胞漿破壞視消化時(shí)間而異,但核破壞較輕)。
6、如果在常用的緩沖液中無(wú)法實(shí)現(xiàn)抗原修復(fù),或經(jīng)修復(fù)后抗原定位發(fā)生改變,可改用一些不常用的緩沖液,或加一些螯合劑,如EDTA等可改善某些抗原的修復(fù)。
三、AR的標(biāo)準(zhǔn)化和發(fā)展
抗原修復(fù)的確切原理尚不十分清楚,根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道,推測(cè)可能是:1、溶解、洗脫變性蛋白。2、水解作用。3、微波場(chǎng)內(nèi)離子或極性分子直接碰撞的修復(fù)作用[7]??乖迯?fù)是否可能?理論上研究尚未清楚,但是以高溫、高壓、對(duì)常規(guī)石蠟切片進(jìn)行抗原修復(fù)處理經(jīng)驗(yàn)表明,可以提高抗原抗體陽(yáng)性檢測(cè)率,同時(shí)也會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。
診斷IHC上的AR技術(shù)及其在基礎(chǔ)領(lǐng)域的研究已被為數(shù)眾多的文獻(xiàn)和比較多的綜述所闡述。此領(lǐng)域的調(diào)查目的:從分子生物學(xué)診斷常規(guī)上,在石蠟組織中檢測(cè)核酸和蛋白質(zhì)新途徑的可能性,從而形成新興的分子形態(tài)學(xué)。一些新的途徑必須建立標(biāo)準(zhǔn)化的原則和提高其重復(fù)性。[19] 。目前我國(guó)病理科大多數(shù)醫(yī)院病理科尚未在IHC、AR上標(biāo)準(zhǔn)化,國(guó)外已廣泛進(jìn)行進(jìn)行AR的標(biāo)準(zhǔn)化及IHC標(biāo)準(zhǔn)化[20]。例如在建立新的修復(fù)液方面,針對(duì)不同的抗體預(yù)定義加熱條件和液體濃度、PH值、化學(xué)成分,從而推動(dòng)AR的標(biāo)準(zhǔn)化。
現(xiàn)AR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于免疫組化(IHC)各領(lǐng)域的研究,例如在診斷病理學(xué)和IHC的標(biāo)準(zhǔn)化方面。對(duì)原來(lái)僅表達(dá)在冰凍切片上的抗原,利用AR后絕大部分抗體能用于常規(guī)甲醛固定的石蠟切片上,對(duì)IHC回顧性研究和病理IHC鑒別診斷,腫瘤患者術(shù)后的預(yù)后檢測(cè)及療效評(píng)估具有積極的意義。
信帆生物公司主要代理產(chǎn)品:
ELISA試劑盒:進(jìn)口ELISA試劑盒,國(guó)產(chǎn)ELISA試劑盒,人elisa試劑盒,大鼠ELISA試劑盒,小鼠ELISA試劑盒等。
培養(yǎng)基:微生物培養(yǎng)基,顯色培養(yǎng)基,BD培養(yǎng)基,gibco培養(yǎng)基等。
血清:胎牛血清,人血清,動(dòng)物血清,NQBB,Hyclone,Gbico原裝血清 。
生物試劑:Amresco,Sigma,ABM,BIO-RAD,BD,ABCAM等進(jìn)口試劑。
標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照品:進(jìn)口對(duì)照品,進(jìn)口對(duì)照藥材,進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)品.
抗體:一抗,二抗,流式抗體等。
放免試劑盒:進(jìn)口放免試劑盒,國(guó)產(chǎn)放免試劑盒,進(jìn)口美國(guó)鳳凰等放免試劑盒。
實(shí)驗(yàn)室代測(cè)服務(wù):放免代測(cè),WB實(shí)驗(yàn),免疫組化代測(cè),熒光定量PCR代測(cè),病理細(xì)胞染色代測(cè),生化實(shí)驗(yàn)代測(cè)等。