葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）試劑盒說明書 分光光度法 50 管/24 樣 正式測定前取 2-3 個預(yù)期差異的樣本做預(yù)測定 測定意義 GOD（EC 1.1.3.4）廣泛存在于動物、和植物中，催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，并產(chǎn)生 H2O2， 是生物體中產(chǎn)生活性氧的代謝途徑之一。 測定原理 GOD 催化產(chǎn)生 H2O2，過氧化物酶催化 H2O2氧化 4-氨基安替比林偶聯(lián)酚，生成有色化合物， 在 500 nm 有特征吸收峰，顏色深淺與 GOD 活性成線性關(guān)系。 試驗中所需的儀器和設(shè)備 可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研缽、冰、蒸 餾水 試劑的組成和配制 提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存； 緩沖液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存； 試劑一：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 20mL 緩沖液充分溶解待用；用不完的試劑 4℃ 保存一個月； 試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 20mL 緩沖液充分溶解待用；用不完的試劑 4℃ 保存一個月； 樣品測定的準備 1、細菌、細胞或組織樣品的制備： 細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量 （104個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提 取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 2、血清（漿）樣品：直接檢測。 測定步驟 1、 分光光度計或酶標儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 500nm，蒸餾水調(diào)零。 2、 試劑一和試劑二的配制：參見試劑的組成和配制。 3、煮沸樣本的準備：取 500μL 樣本至新的 EP 管中，95℃水浴 10min，冷卻至室溫后，8000g 4℃離心 10min，取上清作為對照管的煮沸樣本待測。 4、測定操作表 試劑（μL） 對照管 測定管 樣本 250 煮沸樣本 250 試劑一 375 375 試劑二 375 375 混勻，35'C 保溫 15min 后，于 500nm 波長處讀取吸光度。ΔA=A 測定管-A 對照管。每個測 定管需設(shè)一個對照管。GOD 活力單位的計算 1、標準條件下測定回歸方程為 y = 2.8348x - 0.0169；x 為 H2O2標準品濃度（μmol/mL），y 為ΔA。 1、血清（漿）GOD 活力的計算 單位定義：每 mL 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol H2O2為一個酶活力單位。 GOD（nmol/min/mL）= (ΔA+0.0169) ÷2.8348×V 反總÷V 樣÷T×1000=58.8×(ΔA+0.0169) 2、細菌、細胞或組織 GOD 活力的計算 （1）按蛋白濃度計算 單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol H2O2為一個酶活力單位。 GOD（nmol/min/mg prot）=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V 反總÷(V 樣×Cpr) ×1000÷T =58.8×(ΔA+0.0169)÷Cpr （2）按樣本鮮重計算 單位定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol H2O2為一個酶活力單位。 GOD（nmol/min/g 鮮重）=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總) ×1000÷T =58.8×(ΔA+0.0169)÷W （3）按細菌或細胞密度計算 單位定義：每一萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol H2O2為一個酶活力單位。 GOD（nmol/min/104 cell）=(ΔA+0.0169) ÷2.8348×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總) ×1000÷T =0.118×(ΔA+0.0169) V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.625mL； V 樣：加入樣本體積，0.25mL；V 樣總：加入提取 液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，15 min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬 |
