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COIP實(shí)驗(yàn)代測(cè)

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COIP實(shí)驗(yàn)代測(cè)

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CoIP)是研究蛋白-蛋白間相互作用的經(jīng)典方法,屬于免疫沉淀技術(shù)的一類,常被用于鑒定特定蛋白復(fù)合物的中未知蛋白組分。

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COIP實(shí)驗(yàn)代測(cè)

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CoIP)是研究蛋白-蛋白間相互作用的經(jīng)典方法,屬于免疫沉淀技術(shù)的一類,常被用于鑒定特定蛋白復(fù)合物的中未知蛋白組分。

服務(wù)說(shuō)明

  1. 細(xì)胞培養(yǎng)(貼壁細(xì)胞:100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中單層細(xì)胞長(zhǎng)滿80-90%或者細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞達(dá)到2-5×107個(gè),懸浮細(xì)胞:離心收集細(xì)胞,細(xì)胞達(dá)到2-5×107個(gè));
  2. 1ml800uL)冰冷的 IP細(xì)胞裂解液到細(xì)胞培養(yǎng)皿中【IP裂解液中加入蛋白酶抑制劑(1:50)和PMSF1:100,如果蛋白磷酸化水平影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果則應(yīng)加入磷酸酶抑制劑(1:100,注意抑制劑要現(xiàn)加現(xiàn)用】4℃裂解細(xì)胞10min,再用移液器反復(fù)吹打貼壁細(xì)胞,然后將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中;
  3. 1ml(400uL)冰冷的IP細(xì)胞裂解液【IP裂解液中加入蛋白酶抑制劑(1:50)和PMSF1:100,如果蛋白磷酸化水平影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果則應(yīng)加入磷酸酶抑制劑(1:100,注意抑制劑要現(xiàn)加現(xiàn)用】洗滌細(xì)胞培養(yǎng)皿,將殘留裂解細(xì)胞轉(zhuǎn)入15ml離心管中;
  4. 10000g4℃離心細(xì)胞裂解懸浮液10min,將上清轉(zhuǎn)入新的15ml離心管中,冰上操作,然后測(cè)定蛋白濃度(取少量細(xì)胞裂解液變性后用于WB檢測(cè)目的蛋白);

選做:A.向細(xì)胞裂解液上清中加入1.0μg IgG(與IPCOIP實(shí)驗(yàn)一抗種屬來(lái)源相同的普通IgG)和20μL A/G-珠子(使用前充分混勻),4℃搖轉(zhuǎn)孵育30min

  1.       ℃離心細(xì)胞裂解液5min,將上清轉(zhuǎn)入一個(gè)新的15ml離心管中,冰上操作,然后測(cè)定蛋白濃度(取少量細(xì)胞裂解液上清變性后用于WB檢測(cè)目的蛋白);
  2.  

5.  取以上細(xì)胞裂解液上清1ml(或者100-500μg細(xì)胞總蛋白)到1.5ml離心管中,加入1-10μL0.2-2μg)一抗(同時(shí)加相同量的與一抗種屬來(lái)源相同的普通IgG作為陰性對(duì)照),然后4℃孵育1h(一般加入1.0μg一抗,具體一抗加入量根據(jù)IP級(jí)抗體使用說(shuō)明書進(jìn)行稀釋)

6.  再加入20μL A/G-珠子(使用前充分混勻),用手指輕輕彈勻,4℃搖轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜;

7.  4 1000g離心5min,小心吸去上清,注意不要吸到底部的珠子,收集免疫沉淀復(fù)合物;

8.  將免疫沉淀復(fù)合物用1ml冰冷的IP裂解液(不用加各種抑制劑)洗滌4次,每次4 1000g離心5min,每次洗滌小心棄去上清;

9.  zui后一次洗滌之后,小心棄去上清后,加入40μL 1×SDS含巰基乙醇的上樣緩沖液,沸水煮10min(除去Agrose-proteinA/G同時(shí)將一抗變成重鏈分子55KD和輕鏈分子25KD)后41000g離心5min取上清;

10. 20μL上清樣品用于WB檢測(cè)(選擇不同種屬的抗體分別進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和WB實(shí)驗(yàn),這樣再選擇一個(gè)種屬交叉反應(yīng)比較弱或者無(wú)種屬交叉反應(yīng)的二抗進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn),可以大大減弱抗體分子的重鏈和輕鏈分子的WB信號(hào)。)

實(shí)驗(yàn)材料1.Agrose-proteinA/GSanta  貨號(hào):SC-2003

2.IP細(xì)胞裂解液配方:

Tris-HCl(PH7.4,50mM)         6.055g

NaCl150mM              8.766g

0.25%脫氧膽酸               2.5g

1 NP40                    10ml

EDTA(1mM)                  0.29225g

加純水定容至1L

COIP實(shí)驗(yàn)代測(cè)

 

注意事項(xiàng)

1. 免疫共沉淀是建立在蛋白復(fù)合物成員間彼此緊密結(jié)合的基礎(chǔ)上,意味著松散結(jié)合的蛋白組分很可能檢測(cè)不到;

2. 由于蛋白質(zhì)形成復(fù)合物以后,某些表位就會(huì)被掩蓋,因此可能導(dǎo)致使用某一種pull-down抗體,無(wú)論怎么增加抗體濃度,也極少能將不到一半的目標(biāo)蛋白復(fù)合物沉淀出來(lái),如有必要使用多種不同抗體分別進(jìn)行CoIP;

3. 由于檢測(cè)的是天然狀態(tài),因此在不同的時(shí)間和不同的處理下,CoIP拉下來(lái)的蛋白復(fù)合物都可能是不同的,當(dāng)然隨著實(shí)驗(yàn)次數(shù)的增加,得到的蛋白復(fù)合物成員也會(huì)越來(lái)越龐大;

4. 如果使用Western Blot的方法檢測(cè)的蛋白復(fù)合物中的目標(biāo)蛋白,則需要在試驗(yàn)前進(jìn)行預(yù)測(cè),具有一定的冒險(xiǎn)性;當(dāng)然如果將蛋白復(fù)合物直接進(jìn)行質(zhì)譜分析就不存在上述問(wèn)題,但需要得到較高純度和濃度的蛋白復(fù)合物樣品也非易事,并且成本較高;

5. CoIP鑒定得到的蛋白間相互作用可能是直接作用也可能是間接作用,進(jìn)一步區(qū)分還需要進(jìn)行GST-Pull down等實(shí)驗(yàn)檢測(cè);

6. 為了保證CoIP實(shí)驗(yàn)的可靠性和嚴(yán)謹(jǐn)性,需要使用復(fù)合物的不同成員分別獨(dú)立進(jìn)行CoIP實(shí)驗(yàn),并且結(jié)果應(yīng)該能夠彼此驗(yàn)證,因?yàn)樵瓌t上使用復(fù)合物的任一成員進(jìn)行CoIP都會(huì)得到其他所有成員

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