real-time PCR實(shí)驗(yàn)檢測
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Real-Time PCR 技術(shù),又稱實(shí)時定量熒光PCR,是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號累積實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,Z后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行總量分析或通過Ct值對模板進(jìn)行相對定量。real-time PCR實(shí)驗(yàn)檢測
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real-time PCR實(shí)驗(yàn)檢測
Real-Time PCR 技術(shù),又稱實(shí)時定量熒光PCR,是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號累積實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,zui后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行總量分析或通過Ct值對模板進(jìn)行相對定量。
服務(wù)說明
熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)步驟
1、總RNA抽提(槍頭和離心管均經(jīng)過濕熱滅菌,無RNA酶)
1)取勻漿器,加入1ml的Trizol Reagent,置冰上預(yù)冷。
2)取100mg組織,加入到勻漿器中。
3)充分研磨直至無可見組織塊。
4)13000g離心10min取上清。
5)加入250 μl,顛倒離心管15s,充分混勻,靜置3min。
6)4℃下13000g離心8min。
7)將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中,加入0.8倍體積的異丙醇,顛倒混勻。
8)-20℃放置15min。
9)4℃下13000g離心10min,管底的白色沉淀即為RNA。
10)吸除液體,加入75%乙醇1.5ml洗滌沉淀。
11)4℃下13000g離心5min。
12)將液體吸除干凈,將離心管置于超凈臺上吹3min。
13)加入20μl無RNA酶的水溶解RNA。
14)55℃孵育5min。
2、反轉(zhuǎn)錄(槍頭和PCR均經(jīng)過濕熱滅菌,無RNA酶)
1)取一PCR管,加入含2μg RNA的溶液。
2)加入1μl oligo(dT)15。
3)用無核糖核酸酶的去離子水補(bǔ)足至12μl。
4)于PCR儀上70℃保溫5min,迅速置冰上冷卻。
5)依次加入4μl 5×buffer,2μl 10mM dNTPs,1μl RNA inhibitor和1μl 反轉(zhuǎn)錄酶,用槍抽吸混勻。
6)于PCR儀上42℃保溫60min,結(jié)束后80℃保溫5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。
3、定量PCR
1)取0.2ml PCR管,配制如下反應(yīng)體系,每個反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管。
2× qPCR Mix 12.5μl
7.5μM基因引物 2.0μl
反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.5μl
ddH2O 8.0μl
2)取0.2ml PCR管,配制如下反應(yīng)體系,每個反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管。
2×qPCR Mix 12.5μl
7.5μM內(nèi)參引物 2.0μl
反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.5μl
ddH2O 8.0μl
3)PCR擴(kuò)增
預(yù)變性 95℃,10min
循環(huán)(40次) 95℃,15s→60℃,60s
溶解曲線 75℃→95℃,每20s升溫1℃
4、結(jié)果處理
ΔΔCT法:
A=CT(目的基因,待測樣本)- CT(內(nèi)標(biāo)基因,待測樣本)
B=CT(目的基因,對照樣本)- CT(內(nèi)標(biāo)基因,對照樣本)
K=A-B
表達(dá)倍數(shù)=2-K
real-time PCR實(shí)驗(yàn)檢測
注意事項(xiàng)
1、長度:15—30bp。
2、G十c含量:應(yīng)在40%一60%之間。
3、堿基分布的隨機(jī)性
4、引物自身:不要含有自身互補(bǔ)序列,否則會形成發(fā)夾樣二級結(jié)構(gòu)。
5、引物之間:兩個引物之間不應(yīng)有多于4個的互補(bǔ)或同源堿基,不然會形成引物二聚體,尤應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)重疊。
6、上下游引物的互補(bǔ)性:一個引物的3‘末端序列不允許結(jié)合到另一個引物的任何位點(diǎn)上。
7、3’末端:如果可能的話,每個引物的3‘末端堿基應(yīng)為G或C。
8、設(shè)計(jì)RT-PCR的引物時,上下游引物要跨內(nèi)含子,以消除基因組DNA的干擾。
9、引物設(shè)計(jì)好后再NCBI上進(jìn)行序列比對,檢查是否可能有錯配產(chǎn)物擴(kuò)增。
10、引物設(shè)計(jì)要注意種屬。