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γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶（GCL）實(shí)驗(yàn)代測(cè)

檢測(cè)意義：GCL是GSH合成的限速酶，GSH對(duì)GCL有反饋抑制作用。GCL基因表達(dá)受多種因素調(diào)節(jié)，如氧化劑、抗氧化劑、生長因子和炎癥因子等。GCL活性高低對(duì)GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影響。
檢測(cè)原理：在ATP和Mg2+存在下，GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸；同時(shí)ATP去磷酸化產(chǎn)生無機(jī)磷分子，通過測(cè)定無機(jī)磷增加速率，即可計(jì)算出GCL活性。
自備儀器及用品：冷凍離心機(jī)、水浴鍋、移液器、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、濃硫酸和蒸餾水。
試劑組成及配置：試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。 
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加6mL蒸餾水充分震蕩溶解。 
試劑三：粉劑×1 管，4℃保存。臨用前加入蒸餾水1.5mL充分震蕩溶解。 試劑四：液體×1 瓶，室溫保存。 試劑五：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入12 mL蒸餾水，充分震蕩溶解后，緩緩加入400µL
濃硫酸（自備），邊加邊攪拌。
粗酶液提取： 
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加
入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。 
2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500
萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。血清等液體：直接測(cè)定。

γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶（GCL）實(shí)驗(yàn)代測(cè)