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羥脯-氨酸(HYP)測定試劑盒 生化試劑

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羥脯-氨酸(HYP)測定試劑盒在氧化劑的作用下所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物與二甲氨基苯甲醛作用呈現(xiàn)紫紅色,根據(jù)其呈色的深淺可推算出其含量。

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羥脯-氨酸(HYP)測定試劑盒

(堿水解法)

一、測定原理:

羥脯-氨酸在氧化劑的作用下所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物與二甲

氨基苯甲醛作用呈現(xiàn)紫紅色,根據(jù)其呈色的深淺可推算出

其含量。

二、試劑盒組成與配制:(50 /48 樣)

試劑一:粉劑×1 瓶,甲液 10mL×1 瓶,乙液 20mL×1 瓶,

臨用時將粉劑一瓶,先加甲液 10mL 充分溶解(從

瓶口向內看,溶解完)。然后再加乙液 20mL

充分混勻。配好后的試劑 4℃8℃冰箱保存 3

月有效[注]:粉劑加甲液 10mL 后一定要溶

解后才能加乙液。

試劑二:液體 30mL×1 瓶,4℃冰箱避光保存 3 個月有效。

試劑三:粉劑×1 瓶,溶劑 30mL×1 瓶,臨用時將粉劑一支

加到 30mL 溶劑中充分溶解,配好后 4℃冰箱避光

保存 1 個月有效。

試劑四:羥脯-氨酸標準品 5mg×3 支,4℃冰箱保存 6 個月。

100µg/mL 標準貯備液的配制:測試前將一支標準品用雙

蒸水溶解后定容至 50mL,4℃冰箱保存 2 周。

5µg/mL標準應用液的配制:100µg/mL標準貯備液1mL

加雙蒸水定容至 20mL,現(xiàn)用現(xiàn)配。

樣本前處理試劑(4℃保存):堿水解液 60mL×1 瓶;調 pH

指示劑 5mL×1;瓶;調 pH 甲液 60mL×1 瓶;調 pH

乙液 30mL×1 瓶;活性炭×1 袋。

三、羥脯-氨酸的測定:

(一)、樣本前處理:

1、樣本水解:

①、血清(漿): 0.5mL 血清(漿)準確加水解液 1mL,

混勻。放試管中加蓋后,95℃或者沸水浴水解

20 分鐘。

②、尿液(培養(yǎng)液): 1.0mL 尿液(培養(yǎng)液)準確加水

解液 1mL,混勻。放試管中加蓋后,95℃或者

沸水浴水解 20 分鐘。

③、組織:精確稱取組織濕重 30100mg 放入試管中,準

確加水解液 1mL,混勻。加蓋后 95℃或者沸

水浴水解 20 分鐘(水解 10 分鐘時混勻一次,

目的是使水解更充分)。

2、調 pH 值至 6.06.8 左右。

①、將各試管流水冷卻后各管加指示劑 10μL,搖勻;

②、各管準確加入調 pH 甲液 1.0mL,混勻(此時溶液應為

紅色);

③、 200μL 的加樣器吸取調 pH 乙液向各管內逐滴小心

加入調 pH 乙液,每滴加入后均要混勻*,直至液體中

指示劑的顏色變成黃綠色**(亦即紅色消失時)。此時

pH 值在 6.06.8 左右(約加入調 pH 乙液 100μL

500μL 左右);

* 加調 pH 乙液時,每加一滴均要混勻,為防止液體外溢,

如果沒有帶蓋的玻璃磨口試管,可用普通玻璃試管代

替,每次混勻時可用塑料薄膜或冰箱保鮮膜壓住試管

口,充分旋渦混勻即可。

**若您的樣本是細胞培養(yǎng)液,因其中含有酚紅,所以液體

中的混合指示劑在 pH 6.06.8 左右時為橙黃紅色,

而不是黃綠色。

④、然后加雙蒸水至 10mL,混勻;

⑤、 34mL 稀釋的水解液加適量活性炭(約 2030mg

左右,以上清液離心后澄清無色為準),混勻,3500

/分離心 10 分鐘,小心取上清 1mL 作檢測。

1:樣本堿水解法的參考取樣量:皮膚組織濕重 0.03

0.05g,軟骨濕重 0.080.1g,肝組織濕重 0.080.1g,

細胞培養(yǎng)液 0.5mL,血清(漿)0.5mL。

2:加水解液及調 pH 值甲液一定都要準確,否則較難調

PH 值。

3:樣本稱重時,一定要很精確,以免影響測定結果。先

將組織在保鮮薄膜上剪成濕重約 10mg 左右的塊狀后

再連同保鮮薄膜一起稱重,稱完后將樣本放進試管中,

再將保鮮薄膜稱重,計算出組織凈重量。

4:如果您的樣本量少,則可以從取樣、水解、調 pH

均按比例減少,不響結果。

5:每次混勻時可用塑料薄膜或冰箱保鮮膜壓住試管口,

充分旋渦混勻,以免混勻過程中液體外濺。

695℃或者沸水浴時可以用帶蓋的玻璃磨口試管,也

可用普通玻璃試管代替,用保鮮薄膜封口扎緊,用

針頭刺一小孔即可。我們建議用普通玻璃試管比帶

蓋的玻璃磨口試管更安全。

五、測定意義

羥脯-氨酸在膠原蛋白中占 13.4%,在彈性蛋白中占極少

量,其它蛋白中均不存在。而膠原蛋白大多分布在皮膚、

腱、軟骨、血管等處,因此羥脯-氨酸的量能反映結締組織

疾病的膠原代謝情況。

有人把皮膚中羥脯-氨酸的測定作為篩選抗衰老藥物的

一個指標。在發(fā)育階段隨年齡的增長,其羥脯-氨酸在尿中

排泄增加,而發(fā)育停止后穩(wěn)定。老年人的羥脯-氨酸比年輕

人要少。

鼠患有自發(fā)性高血壓及繼發(fā)性高血壓時,尿中羥脯-氨酸

含量增加。

手術創(chuàng)傷會導致尿羥脯-氨酸排泄量的增加,因高脂、低

蛋白、酒精中毒及毒物、營養(yǎng)不良,或肝細胞變性壞死,

通過炎癥使纖維增加,分割肝小葉,導致肝硬化。肝纖維

化時,肝內主要增加的成分為膠原纖維,羥脯-氨酸為膠原

纖維所特-有,測定肝羥脯-氨酸的含量,可換算成肝膠原蛋

白的含量,以反映肝纖維化程度。膠原纖維分解主要依賴

膠原酶和其它蛋白酶的作用,其分解產(chǎn)物羥脯-氨酸從尿中

排出,測定尿羥脯-氨酸的含量,可反應膠原降解的情況。

通過測定組織及尿中羥脯-氨酸的含量,一方面可以判斷纖

維化程度,同時可以篩選預防與治療的藥物。

羥脯-氨酸(HYP)測定試劑盒 

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